МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЕ МУТАЦИЙ KRAS, NRAS И BRAF ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ (ОБЗОР)

Abstract

Колоректальный рак (КРР) представляет собой злокачественное новообразование, развивающееся из эпителия толстой и прямой кишки. В основе патогенеза КРР лежит активация пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Активация EGFR приводит к стимуляции роста опухоли, ингибированию апоптоза, сосудистой пролиферации, а также инвазии и метастазированию опухолевых клеток. Сигнальный каскад, инициируемый EGFR, включает малые ГТФазы семейства RAS (HRAS, KRAS и NRAS) и киназы семейства RAF (ARAF, BRAF и CRAF). В настоящее время анализ на наличие мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF включён во все клинические рекомендации по диагностике и лечению КРР. Определение мутационного статуса этих генов позволяет врачам выбрать наиболее эффективные стратегии лечения и повысить качество жизни пациентов. Цель исследования – апробация мультиплексной панели для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF с использованием метода масс-спектрометрии на генетическом анализаторе MassArray Analyzer 4. В качестве образцов были использованы – геномная ДНК U-937, не содержащая искомые мутации, в качестве положительных образцов – искусственно синтезированные образцы, содержащие мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF, а также образцы ДНК, с известным генотипом, выделенным из опухолевой ткани (FFPE-блоки). С помощью программного обеспечения Assay Design Suite подобраны праймеры и составлена мультиплексная панель, включающая в себя 5 мультиплексов для выявления 84 мутаций. Подготовка аналитов, состоящая из трёх этапов: мультиплексная ПЦР, SAP-реакция и реакция удлинения iPlex, проводилась с помощью набора реагентов "PCR Reagent Set, medium". Для анализа результатов мультиплексного генотипирования, а также для первичной обработки и документирования результатов опыта использовали программное обеспечение "MassArray Typer 4.0". По результатам апробации разработанной мультиплексной панели было выявлено, что аналитическая чувствительность выявления мутантных аллелей составляет 1%, также показано отсутствие неспецифических выходов при анализе геномной ДНК U-937, смешанных контрольных образцов и образцов ДНК, выделенных из FFPE блоков. Разработанная панель позволяет провести мультиплексное высокоточное генотипирование значимых мутаций в исследуемых образцах методом масс- спектрометрии и подходит для рутинной работы.